W chwili obecnej niewiele wiadomo na temat fabuły. Twórcy ujawnili, że głównym bohaterem będzie szlachcic i asasyn imieniem Ezio Auditore de Firenze. Podobnie jak Altaïr z pierwszej części gry, jest on praprzodkiem Desmonda Milesa, współczesnego asasyna przetrzymywanego przez korporację Abstergo Industries[3]. Ezio jest młodym szlachcicem, który stracił rodzinę. Na pierwszych oficjalnych szkicach przedstawiany jest z dwoma ostrzami asasyna.

Akcja gry rozgrywa się w renesansowych Włoszech podczas weneckiego karnawału w 1476 roku, dwieście osiemdziesiąt pięć lat po wydarzeniach przedstawionych w pierwszej części[2]. W Assassin’s Creed II ponownie pojawią się postaci historyczne, tym razem będą to Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Caterina Sforza oraz Lorenzo de' Medici.[2]

Ujawnione dotąd lokacje, które odwiedzi bohater, to Wenecja, Florencja, toskańska wieś oraz Rzym[2]. Wśród odwzorowanych lokacji znajdą się m.in. bazylika św. Marka w Wenecji, kanał Grande oraz most Rialto[2].